（1）APP的復蘇培養：將胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）加入到11個培養管（20 mL/管）中，每管5 mL，并加入煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD），將各種血清型的APP菌株與甘油混合液（體積比1∶1）從-80℃冰箱中取出，每個培養管100 μL，放入到37℃培養箱中培養24小時。如果24小時后培養管渾濁就表明APP生長良好。

（2）酚水抗原的制備：從培養管取出APP的24小時培養物，溶解在適量PBS中，以5 000轉/分鐘離心10分鐘，棄掉上清液，菌體沉淀用PBS洗兩次。菌體沉淀用適量的68℃蒸餾水稀釋。充分混勻后加入等體積、同溫度的90%酚，在68℃水浴鍋中水浴20分鐘，每過2分鐘取出，上下攪拌混勻。水浴結束后立即取出，冷卻冰浴10分鐘，然后再在4℃離心機中以7 500 轉/分鐘離心20分鐘，取水相；再重復上一次做法，再加入上次同量的68℃蒸餾水，水浴、攪拌、冰浴、取水相。將兩次取出的水相混合就是酚水抗原。

（3）瓊脂凝膠板的制備：按照每100 mL蒸餾水含8.5 g氯化鈉、1.0 g瓊脂粉、0.1 g硫柳汞配置。取所需材料量在微波爐中用沸水融化，按照制板分裝。待冷卻后用打孔器打孔，孔徑5 mm，孔距5 mm，孔深3 mm。再稍微用酒精燈烘烤底面，使其底面瓊脂與玻璃板粘連緊密以防止加樣滲漏。

（4）加樣：按照所需在孔中加入抗原和待測血清（原待測血清用PBS稀釋4倍后），中間孔加各種APP血清型的抗原（或待測血清），周圍孔加入待測血清（或抗原），設置陰、陽性對照孔，每孔加滿為宜，但不要溢出。

（5）加樣好的瓊脂板放入濕盒中，再將濕盒放入37℃恒溫箱中，放置24小時后觀察結果。

（6）中央孔加酚水抗原，周圍孔加入待測血清，24小時溫育后，陽性反應即待測血清和抗原之間會出現一條白色的特異沉淀線，該沉淀線會靠近抗原孔。血清型1、9、11型之間，血清型3、6之間，為了消除非特異性沉淀線的干擾，可以在有交叉反應的血清中加入非對應的血清型菌體，在37℃中震蕩吸收2小時，以7 000 轉/分鐘離心15分鐘除去菌體，如果吸收完全，可以去除非特異性沉淀線。例如血清型1型血清用血清型9型菌體吸收后，可以消除交叉反應。也可以通過白色沉淀線的清晰度來辨認非特異性和特異性沉淀線。

2.2 ApxⅣ-ELISA試驗方法嚴格按照檢測試劑盒說明書進行試驗。

（1）稀釋樣品：在血清稀釋板中按照1∶40的體積稀釋待檢血清，195 μL樣品稀釋液中加入5 μL待檢血清樣品。對照組稀釋：在血清稀釋板中按照1∶4分別稀釋陽性對照和陰性對照血清，180 μL樣品稀釋液中加入60 μL對照血清。

（2）取抗原包被板，將稀釋好的待檢血清、陽性對照和陰性對照血清各取100 μL加入到抗原包被板中，待檢血清設1孔，陽性對照、陰性對照血清各設2孔。輕輕振動樣品，使其充分混勻，放置在37℃下溫育30分鐘。

（3）溫育后，甩掉板孔中的液體，用洗滌液洗板5次，每次200 μL，每次靜置3分鐘后倒掉洗滌液，并在干凈吸水紙上拍干。    

（4）每個孔加入羊抗豬酶標二抗100 μL，放置在37℃下溫育30分鐘。

（5）溫育后洗滌5次，方法同步驟（2）。

（6）每個孔加入底物A和底物B各1滴（約50μL），混勻后，放置在室溫下（20～25℃）避光顯色10分鐘。

（7）每個孔加入終止液1滴（約50 μL），10分鐘內測定結果。結果判定：在酶標儀上測各孔的OD630 nm值。試驗成立的條件是：陽性對照孔OD630nm值均≥0.6；陰性對照孔OD630 nm值均＜0.3。如果N（待檢樣品孔OD630 nm值）≥M（陽性對照孔平均OD630nm值）×0.25，判定為陽性；如果N＜M×0.25，則判定為陰性。

03 結果

表1 瓊脂擴散試驗檢測APP分型結果（份）

表2 部分省份豬場APP感染調查結果

04 分析討論

經瓊脂擴散試驗，可以計算出1 187份血清中陽性血清有378份，陽性率占31.84%。378份陽性血清中感染APP的血清型7型有56份，占14.81%；血清型11型有52份，陽性率占13.76%；血清型10型有48份，陽性率占12.70%；血清型13型有44份，陽性率占11.64%；血清型5型有43份，陽性率占11.38%；血清型1型有40份，陽性率占10.58%；血清型3型有28份，陽性率占7.41%；血清型12型有20份，陽性率占5.29%；血清型4型有19份，陽性率占5.02%；血清型9型有17份，陽性率占4.50%；血清型6型有11份，陽性率占2.91%。由此可見，在APP陽性感染血清中，7型的感染率排在首位，11、10、13、5、1型位居其后，感染陽性率差別不大。這與以前多數關于我國APP流行病學的報道一致。經統計，湖北地區APP感染陽性率有23.18%，湖南某養豬場APP感染陽性率為87.5%，四川某養豬場為20.63%，山東某養豬場為65.66%，福建某養豬場為42.5%。從ApxⅣ-ELISA試驗的結果可以看出，湖北、福建、山東總體APP感染平均陽性率為59.21%，湖北地區APP陽性感染率達64.61%，其中2號豬場部分豬的感染率高達100%，3號豬場的陽性感染率也達到了88.33%。由此可見湖北地區的APP感染情況還是很嚴重?？赡苁且驗?號和3號養豬場的規模比較大，飼養密度過大，APP感染和傳播的可能性提高。福建和山東地區也有不同程度的APP感染。仔豬APP的感染率不高，育肥豬的感染率平均為75%，種豬感染率為55.24%。這個結果和之前多數文獻報道APP主要感染1～4月齡的育肥豬是一致的。仔豬體內可能還有母源抗體存在，以及仔豬飼料里面的添加劑含有某些抗生素之類的藥物，對APP的感染有很好地抑制作用，這些都使得APP感染仔豬的可能性降低。育肥豬的感染率相對較高，可能是與母源抗體的消失以及抗生素的攝取減少、豬舍飼養密度過大、衛生條件差、生活環境改變等因素有關，還可能是因為育肥豬感染了其他傳染病，使得抵抗力和免疫力降低，從而給PCP的發生帶來了可能，發展成為混合感染?？傊?，這些豬場的飼養管理可能存在一些問題，沒有做好預防APP感染的工作，消毒衛生條件差，應激因素多，使得豬傳染性胸膜肺炎發生的可能性大大增加。由以上試驗結果可以看出，APP已經在我國大部分地區存在，陽性率隨著地區、豬場的不同而差別較大，不同的地區、豬場的APP流行程度可能和地理位置、氣候環境、地域海拔以及豬場的規模、管理水平、衛生條件、飼養方式、防治情況等因素相關。豬傳染性胸膜肺炎已經給我國養豬業造成巨大的經濟損失，使養豬業的健康發展受到嚴重威脅。近年來，我國雖然對豬傳染性胸膜肺炎的防治工作做出了巨大努力，也取得了一定的成就，但從調查的結果看，其情況還不容樂觀。對于豬傳染性胸膜肺炎的預防還是要做好以下幾點。首先，應改善飼養環境。嚴格執行衛生消毒措施，對豬舍、豬欄、用具、通道等定期消毒。本病病原菌對許多常用消毒劑敏感，搞好消毒滅菌工作，減少環境中病原菌的數量，可以防止傳染性病原微生物從母豬傳播到仔豬。注意通風換氣，保持舍內空氣清新。其次，加強飼養管理、提高飼養管理水平。減少各種應激因素，保持豬群足夠合理的營養水平。降低豬群飼養密度，改善通風條件，做好保溫防暑，限制舍溫變化過大等各種應激因素，減少急性病例的發生。嚴禁飼喂發霉飼料，防止產生免疫抑制。加強引種安檢，從無病豬場引種，種豬入場前隔離飼養，防止病豬入場。堅持全進全出、隔離飼養、隔離治療的原則，應堅決淘汰那些久治不愈、失去經濟價值的重病豬，杜絕惡性循環。最后，堅持以預防為主、治療為輔、防治結合的原則。做好豬偽狂犬病、豬瘟、喘氣病、藍耳病、副豬嗜血桿菌感染等有關疫病的免疫接種，特別是對一些免疫抑制性疾病。對于本病的免疫預防，可選用武漢科前動物生物制品有限責任公司生產的豬傳染性胸膜肺炎三價滅活苗，安全性高，免疫原性好。

05 結論

⑴ 豬傳染性胸膜肺炎在我國湖北、湖南、四川、廣東、福建、山東等地都有不同程度的存在，總平均陽性率為37.02%。

⑵ 我國湖北、湖南、四川、廣東、福建、山東等地豬傳染性胸膜肺炎陽性感染病例中，胸膜肺炎放線桿菌血清型中7型的感染率排在首位，陽性血清中的占有率為14.81%，血清型11、10、13、5、1型占有率位居其后，它們的感染陽性率差別不大。

⑶ 胸膜肺炎放線桿菌主要感染育肥豬，所以育肥豬是本病防治的重點對象。